基于工程教育认证的“发酵工程”课程教学设计与实践

"发酵工程"是生物工程专业的核心主干课程,实践性和应用性较强。基于工程教育认证的产出导向理念,设定了"发酵工程"合理具体的课程目标,聚焦学生的工程知识掌握及问题分析、工程设计及研究能力培养。针对不同课程内容模块,以课程目标达成为导向,对教学内容及方法、教学设计与实施过程进行整合并优化,采用了多元化、注重课程形成性评价的考核方式。构建了课程目标达成评价模式,形成了"设计—实施—考核—评价—改进"闭环运行的课程质量保障体系。课程教学改革有效提高了学生理解、分析、设计、研究发酵工程问题的能力,增强了学生的科研兴趣和创新能力。     

基于成果导向教育理念的“发酵工程实验”课程内容设计及实践

"发酵工程实验"是生物工程专业的工程类重要主干课之一,是培养学生工程设计、工程实践和创新思维的重要课程。基于构思—设计—实现—运行(conceive—design—implement—operate,CDIO)理念,"发酵工程实验"通过构建模块化课程内容,以构思、设计、实现、运作的项目导向模块开展课程设计,进行目标导向的教学模式改革。以"发酵工程实验"课程为载体,将工程基础知识、发酵工程系统实践能力、团队合作能力、创新能力培养等融为一体。建立基于成果导向教育(outcome-based education,OBE)理念的学生学习效果评价体系,完成"发酵工程实验"课程教学任务。学生对改革后的"发酵工程实验"课程满意度明显提高,教学效果显著。     

具核梭杆菌对结直肠癌细胞增殖、迁移及上皮间质转化作用的影响

【目的】评估具核梭杆菌对人结直肠癌细胞HCT116和人正常结肠上皮细胞HCoEpiC的增殖、黏附、凋亡、迁移、侵袭和上皮间质转化的影响。【方法】本研究用不同感染复数(MOI)Fusobacterium nucleatum ATCC 23726感染人结直肠癌细胞HCT116和人正常结肠上皮细胞HCoEpiC,建立感染模型;用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]、平板克隆、细胞划痕及侵袭(transwell)实验检测两组细胞的增殖、迁移和侵袭的变化;用流式细胞仪检测两组细胞凋亡情况;通过Western blotting检测两组细胞上皮标记物上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、Catenin δ-1蛋白、间充质标记物N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达水平的变化。【结果】F.nucleatum可促进HCT116细胞增殖,诱导HCT116细胞的迁移和侵袭,但不能引起细胞凋亡;可抑制HCoEpiC细胞的增殖、迁移和侵袭,并加速其凋亡;对HCT116和HCoEpiC细胞表现出很强的粘附能力,致细胞分散和拉长,细胞间粘附减少;使HCT116和HCoEpiC细胞上皮标记物E-cadherin与Catenin δ-1的表达量减少,间充质标记物N-cadherin与vimentin的表达量上升,E-cadherin由细胞膜向细胞质转移。【结论】F.nucleatum可诱导结直肠癌细胞和人正常结肠上皮细胞发生上皮间质转化,但抑制人正常结肠细胞的增殖、迁移和侵袭,表现出与结直肠癌细胞相反的作用。     

芽胞杆菌产生的环脂肽类物质的研究进展

环脂肽类物质具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性,其潜在的应用价值已逐渐引起了人们的注意。主要针对芽胞杆菌产生的环脂肽,综述了环脂肽类物质的结构及分类、生理活性、生物合成机制。由于环脂肽结构的不同,分离纯化及鉴定方法也会有所差异,因此对环脂肽的分离纯化及鉴定方法方面也做了简单的综述。最后展望了我国对于环脂肽研究的不足及未来的发展前景。     

以agr基因为靶点快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

旨在建立一种以agr基因为靶点,快速检测金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增（LAMP)方法。针对金黄色葡萄球菌附属基因调控基因agr序列,设计了4条特异性引物;优化了LAMP体系中甜菜碱、dNTP浓度、长短引物比等因素;通过对14株不同金黄色葡萄球菌菌株和4株其他常见食品致病菌株进行检测,评估引物特异性。结果表明,在Mg²⁺浓度为2.4 mmol/L,dNTP浓度为0.8 mmol/L,甜菜碱浓度为0.1 mol/L,长短引物比为1:8,65 ℃反应50 min条件下扩增可达最佳效果。优化后的LAMP对14株金黄色葡萄球菌均表现为阳性,对4株非金黄色葡萄球菌菌株表现为阴性,证明引物具有特异性。本文首次利用agr基因作为靶基因片段,建立了一个简单、快速、特异性强的检测金黄色葡萄球菌的方法,在食品安全检测方面极具意义。     

金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型的构建与功能评价

【背景】抗生素的无序使用加剧了耐药性金黄色葡萄球菌超级菌株的出现,由其引发的感染已成为最难解决的感染性疾患。在生物体系外构建AgrA/C双组分系统的跨膜信号转导过程,对解决金黄色葡萄球菌的耐药性问题和发现新型抗菌药物具有重要的研究意义。【目的】人工模拟构建金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型,为生物体外研究金黄色葡萄球菌双组分信号转导的机制及以其为靶点的药物筛选提供新途径。【方法】在大肠杆菌宿主细胞中大量表达AgrA和Agr C蛋白,利用亲和层析和分子筛凝胶层析对其进行分离纯化,利用非放射性凝胶阻滞实验(EMSA)检测AgrA蛋白活性,并检测Agr C激酶活性;进而利用脂质体介导法在体外组装AgrA/C双组分信号转导模型,应用EMSA方法进行评价。【结果】分离纯化得到AgrA和Agr C蛋白,二者纯度均达到90%以上,均具有活性。在生物体系外构建了金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型,该系统可增强AgrA对DNA的延滞作用,具有信号传递功能。【结论】初步构建AgrA/C双组分信号转导模型,该模型具有信号传递能力,有望作为针对金黄色葡萄球菌开发新型抗菌药物的筛选平台。     

基于响应面法对香菇原生质体制备条件的优化

香菇Lentinula edodes是我国食用菌年产量最大的单品,优化香菇原生质体的制备条件,获得高质量、高活力的原生质体可以为香菇育种和遗传多样性分析提供技术保障。本研究利用单因素试验对稳渗剂浓度、酶解液类型、酶解时间、酶解温度4个因素的最优作用条件和相关性进行检验和筛选;依据单因素试验的结果,对酶解时间、酶解温度、酶解液种类进行响应面法3因素3水平试验优化分析。单因素试验结果表明,使用2%的溶壁酶+蜗牛酶+纤维素酶混合酶制剂为酶解液、0.6 mol/L甘露醇为稳渗剂的效果显著高于其他处理(P<0.05)。经Box-Behnken设计得出香菇原生质体最佳制备条件为酶解时间3.25 h,酶解液浓度1.7%,酶解温度30.49 ℃,获得原生质体产量为14.02×10⁶ CFU/mL,与理论产量(13.862×10⁶ CFU/mL)偏差小,可为后续原生质体融合育种和多样性分析提供重要基础。     

具核梭杆菌CarRS双组分系统组氨酸激酶CarS的表达、纯化及生化活性测定

具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)是一种条件致病菌,能够在结直肠癌组织中富集,影响结直肠癌发生发展的多个阶段。双组分系统在病原菌耐药性、致病性相关基因的调控和表达中起重要作用。本文以具核梭杆菌CarRS双组分系统为研究对象,重点对其组氨酸激酶蛋白CarS进行重组表达和性质研究。利用在线软件SMART、CCTOP和AlphaFold2对CarS二级结构和三级结构进行预测,其结果表明CarS蛋白具有2个跨膜螺旋区,包含9个α螺旋和12个β折叠结构;由两个结构域构成,一是位于N末端的跨膜域(氨基酸1–170),另一个是位于C末端的胞内域,胞内域由信号接收域(histidine kinases,adenylyl cyclases,methyl-accepting proteins,prokaryotic signaling proteins,HAMP)、磷酸受体结构域(histidine kinase domain,HisKA)和组氨酸激酶催化结构域(histidine kinase-like ATPase catalytic domain,HATPase_c)组成。由于全长的CarS蛋白未能在宿主细胞中表达,因此根据其二级、三级结构特点,构建了CarS胞内蛋白的融合表达载体pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中进行过表达。经亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,最终获得纯度较高的CarScyto-MBP蛋白,终浓度达20 mg/mL。活性实验结果表明,CarScyto-MBP具有蛋白激酶和磷酸转移酶双活性,麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)标签对CarScyto蛋白的生物活性无影响。上述结果为深入解析CarRS双组分系统在具核梭杆菌中的生物学功能提供了一定的理论基础。     

嗜水气单胞菌群体感应信号分子AI-2的细胞外生物 合成及活性检测

【目的】对嗜水气单胞菌群体感应信号分子AI-2进行细胞外生物合成及活性检测。【方法】对LuxS、MtnN-1、MtnN-2蛋白进行氨基酸序列分析、表达及纯化。以S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)为底物,利用纯化的LuxS分别与MtnN-1及MtnN-2蛋白共同作用合成AI-2,并利用哈维氏弧菌报告菌株BB170检测AI-2活性。【结果】嗜水气单胞菌培养液上清中AI-2活性在8 h达到空白对照的16.96倍。氨基酸序列分析表明,嗜水气单胞菌与水生病原菌哈维式弧菌和迟钝爱德华氏LuxS一致性达到76%以上,MtnN-1与MtnN-2氨基酸序列一致性为26.37%,其中MtnN-2与哈维氏弧菌和迟钝爱德华氏菌Pfs一致性达到53%以上。成功表达及纯化了LuxS、MtnN-1和MtnN-2蛋白,细胞外LuxS和MtnN-1共同作用合成的AI-2活性是空白对照的45.04倍,LuxS和MtnN-2共同作用合成的AI-2活性是空白对照的63.62倍。【结论】嗜水气单胞菌能够合成信号分子AI-2。MtnN-1和MtnN-2氨基酸序列尽管存在较大差异,但两者均能与LuxS共同催化AI-2的细胞外生物合成。     

荧光重组酶介导等温扩增检测食品中单增李斯特菌

[背景] 单增李斯特菌为肉类及乳制品中常见的食源性致病菌,传统的培养法检测无法满足口岸大批量食品的快速检测要求,建立简便、灵敏、快速及现场可操作的技术至关重要。[目的] 建立快速简便的荧光重组酶介导等温扩增（Recombinase-Aided Amplification,RAA）法检测单增李斯特菌,以适应口岸快速通关及监管的实际需求。[方法] 根据单增李斯特菌hlyA基因保守区设计特异性引物、探针,通过引物两两组合结合探针筛选出扩增效率及灵敏度最佳的引物组合,优化反应温度及引物探针浓度,确定最佳反应条件。将建立的荧光RAA法应用于食品基质及实际样品检测中,同时与国标GB 4789.30-2016进行比对验证。[结果] 单增李斯特菌荧光RAA最佳反应温度为42 ℃,最佳引物、探针终浓度均为400 nmol/L。建立的荧光RAA法特异性强,纯菌灵敏度达到3×10² CFU/mL。加标食品基质牛肉、大西洋鲑鱼及再制干酪LB2增菌只需4 h,即可检测原始浓度分别达到0.3、3、30 CFU/mL的单增李斯特菌。荧光RAA法只需5 min即可观察结果,20-30 min完成扩增,速度及灵敏度明显高于国标法。[结论] 建立的荧光RAA法可用于口岸和其他场所进行单增李斯特菌的快速检测与监控。